Experimento 8 – caracterização

Materiais:

Providenciado pelos alunos

ovo (1 p/ cada grupo)

Do laboratório

1 Tubo de ensaio com 5 mL de tampão fosfato 0,1mol/L em pH7.8 – Tubo 1;

1 Tubo de ensaio com 3 mL de solução de ninhidrina 0,1% em tampão fosfato – Tubo 2;

1 Tubo de ensaio com 3 mL de biureto – Tubo 3;

1 Tubo de ensaio com 4 mL de água destilada – Tubo 4;

1 Tubo de ensaio com 6 mL de cloreto de sódio 1M – Tubo 5;

1 Tubo de ensaio com 5 mL de sulfato de amônio 70% (p/v) - Tubo 6;

1 Tubo vazio – 7;

1 Tubo de ensaio com 1 mL de tampão fosfato 0,1mol/L em pH7.8 – Tubo 8;

1 Tubo de ensaio com 1 mL de água destilada – Tubo 9;

10 mg de Caseína (eppendorf plástico)

1 Bastão de vidro;

2 béqueres;

3 Pipetas graduadas de “5 mL”;

HNO₃ 1:1 (na bancada do professor);

NaOH 5M (na bancada do professor);

Banho-maria.

Procedimentos:

Reação da Ninhidrina:

Abrir o ovo separando o seu conteúdo em dois béqueres (clara em um, gema em outro) sem romper a membrana que envolve a gema;

Transferir c/ pipeta aprox. 1 ml de clara para o Tubo 1 (tp. fosfato);

Pipetar 2 ml da solução obtida no passo anterior (Tubo 1) no Tubo 2 (ninhidrina);

Colocar o Tubo 2 no banho-maria, deixando-o ferver por 5 minutos;

Registrar os dados obtidos.

Reação do Biureto:

Pipetar 1 ml da solução do Tubo 1 (sol. clara/ tp. fosfato) para o Tubo 3 (biureto);

Registrar os dados obtidos.

Solubilização (salting in):

Diluir 2mL de clara no Tubo 4 (H₂O dest.), misturar suavemente;

Adicionar a solução de cloreto de sódio do Tubo 5 ao Tubo 4 gota a gota até a solubilização do material;

Registrar os dados.

Precipitação sem desnaturação (salting out):</p>

Adicione solução saturada de sulfato de amônio (Tubo 6) ao Tubo 4 gota a gota;

Registrar os dados.

Reação xantoprotéica:

Colocar 1 ml da clara do ovo do Tubo 1 no Tubo 7;

Adicionar os 10mg de caseína ao tubo 8 e agitar suavemente para solubilizar;

Adicionar aos tubos 7,8 e 9 0,5 ml de ácido nítrico(CUIDADO! Usar pipeta de 5 ou de 10 ml; aspirar c/ pêra, não com a boca, usar luvas);

Anotar os resultados observados e adicionar gota a gota e agitando após cada gota, 1mL de NaOH;

Anotar e analisar os resultados obtidos.

Objetivos :

Entender as propriedades das proteínas e como elas influenciam sua solubilização

Entender alguns métodos para identificação e quantificação de proteínas

Verificar o comportamento de diferentes grupos de biomoléculas em diferentes soluções

Sugestões para o relatório:

Explicar o que são os reagentes Biureto e Ninhidrina e como eles interagem com proteínas.

Explicar as principais diferenças entre os métodos utilizados para identificação de proteínas e em que situações deve ser usado cada um.

Explicar os mecanismos de solubilização e precipitação de proteínas.